物种DNA鉴定的原理，是检测样本中一段或多段具有遗传差异的DNA序列，再与已知物种的参考序列比较，判断样本更符合哪一类生物。它之所以可行，是因为不同物种在长期演化中积累了不同的遗传变异；同时，生物体内也有相对稳定、可供比较的基因区域。鉴定依赖的不是“整条DNA独一无二”，而是选对能够区分目标物种的遗传标记。
遗传标记为何能区分物种
同一物种的个体并非拥有完全相同的DNA，种群内部会有一定变异；但不同物种之间通常也存在可测量的序列差别。鉴定标记需要兼顾这两点：在目标物种内部相对稳定，在近缘物种之间又有足够差异。若某个区域在所有相关物种中都几乎一样，它就难以提供分类信息；若该区域在同一物种内部变化过大，也可能把同一物种的不同个体误判为不同类群。
因此，实验室不会随意读取任意一段DNA，而是依据生物类群和鉴定目的选择标记。动物鉴定常使用线粒体COI基因区域；植物可能使用叶绿体基因区域，如rbcL、matK，也可能结合核基因间隔区；真菌常见标记包括ITS区域。细菌鉴定则常分析16S rRNA基因，但仅凭这一标记有时不足以区分亲缘关系很近的物种。不同标记各有适用范围，不存在一段序列能同样准确地鉴定所有生物。
从样本到物种判断的机制
样本中的DNA可以来自组织、血液、种子、微生物细胞，也可能残留在加工食品或环境样品中。分析时，先从样本提取DNA，再针对目标标记进行扩增或测序。扩增的作用是增加目标区域的数量，使其达到可检测水平；测序则读出该区域的碱基排列。若样本DNA较完整，通常更容易获得连续序列；若样本经过高温、腐败或长期保存，DNA可能断裂，此时较短的标记片段往往更容易检测。
得到序列后，鉴定会将其与经过整理的参考序列进行比对。比较内容包括碱基差异、序列相似程度，以及这些差异在已知物种中的分布。若样本序列与某物种的参考序列高度吻合，并且与近缘物种能够区分，便可支持相应的物种判断。若多个物种的序列相同或极为接近，单一标记就不能提供足够证据，结果可能只能落到属或更高一级分类。
序列相似度不是脱离背景的固定判定线。不同生物类群的遗传变化速度不同，参考数据库的覆盖程度也不一样，因此鉴定标准需要结合目标类群、标记类型和已有分类研究来解释。可靠判断通常关注序列与参考样本的整体关系，而不是仅凭一个百分比作结论。
DNA鉴定的是物种特征，不一定是个体身份
物种鉴定与个体识别是不同任务。常用于物种分类的标记，可能在同一物种的许多个体间完全相同，因此只能说明样本属于哪个物种，不能确认它来自哪一个具体个体。亲缘关系分析或个体身份识别通常需要检测更多具有个体差异的遗传位点。两者都利用DNA信息，但标记选择和比较目的不同。
此外，线粒体或叶绿体DNA通常只反映特定遗传来源，不能总是代表生物全部基因组。杂交、基因渗入、不同物种间的遗传谱系尚未完全分化等情况，可能使某个标记显示的亲缘关系与物种分类不完全一致。样本混合、污染或参考序列标注错误，也会影响比对结果。遇到近缘物种或结论要求较高的情形，结合多个独立标记、形态特征和样本来源信息，通常比依赖单一序列更有解释力。
概括来说，物种DNA鉴定成立的条件是：目标标记能在相关物种间形成有意义的差异，样本序列质量足以支持比较，且参考数据能够覆盖可能的候选物种。DNA提供的是可检验的遗传证据；最终判断的准确程度，取决于标记是否合适以及证据是否足以区分近缘类群。
